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常见肉类鉴别技术研究进展

摘  要：肉类作为我们日常食物的重要组成部分，其真实性是食品安全的关键问题。近年来，食品安全问题，尤其是市场上各种肉类掺杂、掺假事件，成为人们日益关注的焦点。严格监测市场上肉制品，必须要有可靠、简便、快速的技术作支撑。本文综述了现阶段常见肉类鉴别技术的研究进展，并着重描述了聚合酶链式反应(polymerasechain reaction, PCR)技术，因其灵敏度高和特异性高、简便且耗时少，逐渐成为肉类检测的实用技术。

关键词：肉类检测；传统方法；免疫学技术；聚合酶链式反应（PCR）技术

ATechnological Overview for Identification of Common Meat Species

Abstract: Asmeat is an important part of our daily food, the authenticity of meat is amajor issue of food safty. Recently, more of us have been focused on the issuesof food safety, especially the occurrence of meat products adulteration. Todetect and prevent meat species substitution, a kind of reliable, convenientand rapid technologies must be developed. This paper provides an overview ofthe developed approaches and highlights the DNA-based polymerase chain reaction(PCR) technology. Due to the high sensitivity, specificity and convenient ofPCR assay, as well as its low time-consuming, PCR-based techniques will be thepractical technologies to detect meat and meat products.

Key words: meat species identification；traditional methods；immunological technique；polymerase chain reaction (PCR) technique

近年来，食品安全问题频发，食品的卫生与安全逐渐成为人们关注的焦点。我们直击国内的 “老鼠肉、狐狸肉、水貂肉冒充羊肉”事件、“清真招牌下的猪肉冒充羊肉”、“羊肉卷添加猪肉鸭肉”事件和席卷多国的“马肉风波”以及普遍存在的香肠掺杂掺假等现象……这些与价格、原料和宗教有关的种种事件，威胁到人们的日常生活和宗教信仰。由此看来，食品安全问题不可小觑，特别是对肉类的鉴别，这需要我们能够有可靠且可行的方法进行检测。现阶段肉类检测方法众多，包括传统方法与现代方法，经典方法与新兴方法。本文综述了肉类鉴别的主要方法，包括传统感官鉴别、免疫学方法、分子生物学方法以及其它方法。

1  传统方法 

鉴别肉类的传统方法主要包括视觉、嗅觉、触觉、味觉等。视觉鉴别指通过对动物肉的酮体、肌肉纹理和颜色、脂肪等直接观察判断；嗅觉鉴别指对肉品的气味判断鉴别；触觉鉴别指按压生肉品，感知肉品的脂肪、肌肉的硬度和弹性来判别；味觉鉴别是通过对肉品经加工后的味道来判别。仅仅的感官判别远不能够鉴别肉类的真假，可作为辅助手段应用。

2  免疫学方法

免疫学方法主要包括试管沉淀法、琼脂扩散法、对流免疫电泳法、放射免疫法、免疫组化法和酶联免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbnent assay，ELISA)，其中试管沉淀法应用较少，ELISA较为常用。马永征等详细综述了以ELISA为主的免疫学技术在肉类制品检测中的研究进展。ELISA用于肉类鉴别的原理是利用抗体对蛋白的识别来区别肉类品种，包括直接法、间接法、间接竞争法、ABS-ELISA法、组织印记法、捕获包被法、A蛋白酶联法、斑点免疫吸附法和双抗体夹心法。有人综述了ELISA技术在肉类检测中的应用，分析了该技术广泛的应用前景。利用双抗夹心ELISA技术鉴别不同肉类，结果表明该技术有较高的敏感性和特异性，并制成商品化诊断盒，以便于有关部门应用。ELISA技术与传统鉴别技术相比，较灵敏可靠，但存在一些弊端，如目标分子含量低，各种肉类特异性抗体难以制备且存在交叉反应等。

3  分子生物学技术

聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)技术是经典的分子生物学技术，通过设计特异性引物，扩增出特定目的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的DNA片段，以用于鉴别和检测。PCR技术用于肉类鉴别，关键在于能够找到各类物种特异性的基因片段，并设计引物扩增目的片段。现常用线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），原因在于线粒体DNA比核基因小，为环状结构，稳定且数量较多，易于进行PCR扩增；2）线粒体DNA比核基因小，自我复制较快，在一定程度上比核基因进化速度快，导致其存在广泛的种内和种间多态性，适用于相近物种的鉴别；3）线粒体DNA中某些基因区域具有高度保守性，可通过设计通用引物，扩大所鉴别的物种范围。经分析总结，现阶段常用于扩增的线粒体DNA区域包括细胞色素b（cytochrome b,cyt b）、16SrRNA、12SrRNA、D-loop、ATP6和ATP8等，较少应用Myostatin基因 。而本实验室目前以线粒体基因组为模板设计引物，并不局限于某个特定区域，设计方法比较独特。现阶段国内外运用PCR技术以线粒体基因组作为目的基因鉴别肉类的常见应用如表1、表2所示。常用的PCR技术有常规PCR、多重PCR(multiplexPCR)、实时荧光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR，RT-PCR)、限制性片段长度多态性PCR(restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP)、随机扩增多态性PCR（Random AmplifiedPolymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）等。

表1  以PCR技术为基础常见肉类鉴别的国外研究现状

Table 1 A foreign overview of species identification of common meat by PCR

3.1  常规PCR

常规PCR技术指在PCR反应基本组成成分基础上发生聚合酶链反应的技术，同一体系内只有一对引物和单一目的模板，操作简单、快速。侯东军等以猪的细胞色素b基因为模板，设计引物，建立了一种检测牛羊肉中猪肉成分的方法，省时且特异性高。客观看来，常规PCR方法较传统方法灵敏，特异性高，较免疫学方法省时，但缺乏对比，需要多组之间相互比较。

3.2  多重PCR(multiplex PCR)

多重PCR指在传统的常规PCR基础上，于同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的片段。宗卉 等在PCR体系中同时加入通用引物和牛、羊的特异性引物及牛、羊的mtDNA，建立了多重PCR同时检测牛、羊源性成分的技术，特异性高，省时省力。更巧妙的是，等使用多重PCR鉴定了牛、猪、鸡、绵羊、山羊和马 6种肉类，即在线粒体细胞色素b基因上设计了一条通用的上游引物和各自特异的下游引物，于同一体系中扩增出各自特异的目的片段，并同时得到各种DNA样品的检测极限。

值得注意的是，多重PCR技术可同时加入多对引物，同时扩增几个DNA片段，前提是每对引物都能在单一PCR体系中应用且结果理想，当同时将几对引物加入一个体系中，需要重新摸索条件。多重PCR反应体系的设计需要考虑到各对引物及模板的浓度、每对引物的溶解温度和引物之间的相互作用以及目的片段的长度等。建立理想的多重PCR体系可以达到省时、经济、节约的效果。

3.3  实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitativePCR，RT-PCR)

实时荧光定量PCR技术是在常规PCR反应体系中加入荧光基团，根据荧光信号的强度，利用标准曲线、Ct值等对未知模板进行定量分析的方法。RT-PCR技术中TaqMan RT-PCR技术和SYBR Green RT-PCR技术应用最为广泛。前者的原理是根据在PCR扩增时，荧光标记探针被降解，发出荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成的完全同步，通过监测系统来定量；后者的原理是于SYBR荧光染料特异性地插入到DNA双链之后发射荧光信号，使得荧光信号与PCR产物同步增加，同样通过荧光监测系统来定量。本实验室现以马肉线粒体DNA为模板，设计出马的特异性引物，利用RT-PCR技术鉴别马肉及定量肉制品中马肉含量。

TaqManRT-PCR技术可用于单一成分的检测，李林 等应用多重实时荧光定量PCR技术，根据牛、山羊和绵羊线粒体细胞色素b基因的差异，设计出特异性的引物和Taqman探针，建立了能够同时鉴别三者的PCR技术，并与国标方法比对分析，该实验方法无需电泳、酶切和测序，使得检测效率提高近3倍，灵敏度比国标方法高10倍，适用于检测肉类、奶品、生皮、饲料和动物油脂等动物产品的牛羊源性成分；该方法还可以用来确定检测限及定量限，JohnJ. Dooley 等同样在细胞色素b基因上设计出特异性引物和荧光探针，建立了适用TaqMan RT-PCR技术检测牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和火鸡肉的方法，且检测限低于0.1%。Soichi Tanabe  ADDIN EN.CITE等在细胞色素b基因上设计出特异性引物和荧光探针，建立了鉴别食物中微量的猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉和马肉的实时荧光定量PCR方法。该方法使定量极限达到100fg/ul，对加工食品中微量肉源检测有很大的帮助。

SYBRGreen I RT-PCR技术同样可用于定量，杨丽霞 等设计了一对特异性引物，使用SYBR Green I 实时PCR技术，建立了RT-PCR检测牛肉中鸭源性成分的检测方法，检测灵敏度可达到1pg。该方法比较灵敏，但其存在SYBR Green I荧光染料对DNA双链模板无选择性等特点，特异性较TaqManRT-PCR差，但成本较TaqManRT-PCR成本低。

总体来说，荧光定量PCR技术可以在定性的基础上，达到定量检测的要求。与其他PCR方法相比，在PCR技术的高特异性、高灵敏度的基础上，同时做出定量检测，简便可靠，可作为鉴别肉类的实用技术。

3.4  限制性片段长度多态性PCR(restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)

限制性片段长度多态性PCR技术，即PCR-RFLP，是PCR技术和RFLP技术联合应用。该方法通过设计适当的引物，扩增一段含有特定限制性内切酶酶切位点的DNA片段，经酶切和琼脂糖凝胶电泳，得到特异性的条带，以鉴别不同基因型。VioletaFajardo等 详细综述了以PCR技术为基础的肉源性鉴别，给我们提供了大量PCR-RFLP技术在肉类鉴别中的研究与应用。

PCR-RFLP技术现已应用于肉类真实性的检测，如冯海永等在线粒体DNA细胞色素b基因上设计出羊（绵羊、山羊）和鸭的通用引物，扩增出472bp的片段，分别使用限制性内切酶SpeI和Bsu36I对羊和鸭的PCR产物进行酶切，分别得到羊（绵羊、山羊）和鸭的特异性片段为213bp和259bp、95bp和377bp，可作为一种对羊肉和鸭肉快速鉴别的简便可行的方法。该方法也已用于多样品的检测，如高林 提取出猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、鱼的生肉DNA和市售的肉源性食品中肉类的DNA，使用线粒体通用引物（Cytb1/Cytb2）进行扩增，并对特异性阳性结果进行了限制性内切酶Mbo I、Alu I、Sau3A I酶切鉴定，结果表明此种PCR-RFLP方法可准确鉴别制品中相关肉源性成分。

PCR-RFLP方法较经济，操作简单易行，尤其适合多样品的定性研究，较单纯的RFLP方法省时、省力。

3.5  随机扩增多态性PCR（Random Amplified Polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）

随机扩增多态性PCR，即RAPD-PCR，是RAPD技术与PCR技术的联合应用。该技术以PCR技术为基础，设计一系列（通常数百个）互不相同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对目的基因片段进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射自显影来检测PCR产物，以观察DNA片段的多态性。

PCR-RFLP方法在肉类鉴别中的经典应用是在1998年Iciar Martinez ADDIN EN.CITE等利用RAPD-PCR技术成功的鉴别了牛、马（6个品种）、骡、驴、水牛、麋鹿、驯鹿、猪肉、羊羔、山羊、袋鼠、鸵鸟以及其他肉类，并且实验得到清晰的DNA指纹图谱，很容易的辨别出以上样品。该实验表明RAPD-PCR技术不失为是一项简单、可靠和快速的以DNA为基础的分子生物学技术。也分别利用物种特异性的DNA指纹图谱，用此方法鉴定肉制品真实性。

RAPD-PCR技术可以分析已知和未知物种的DNA多态性，且对DNA的纯度要求不高，但是也存在一些不足，因其所用的引物比一般PCR反应短，有时会产生多态性DNA电泳图谱，会使实验结果分析带来困难以及实验重复性差；图谱中的弱带重复性差，在未标准化引物数目、引物长度和反应条件时，结果不具有可比性；假阳性和假阴性结果出现率相对较高。

4  其它分析方法

其他肉类鉴别有关方法包括：a）超声波技术，即根据一些参数的变化检测肉类的物理性质，如肌肉和脂肪厚度，可用于检测肉类组成成分 ADDIN EN.CITE 近红外光谱（nearinfrared，NIR）技术分析，可用于鉴别肉品种类、产地和真伪，此方法简便快速且信息量大、无破坏性，但也存在成本高、频繁维护和改进模型等不理想的方面。这两种技术均无需对肉品进行破坏，且样品能够反复利用，可称为无损检测技术。